乙型肝炎病毒拉米夫定YVDD耐藥株及YMDD野生株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立及鑒定
關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒 ymdd yvdd 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系
摘要：目的建立乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)拉米夫定YVDD耐藥株及YMDD野生株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。方法利用攜帶有HBV拉米夫定YVDD耐藥株或YMDD野生株的全基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,G418篩選后建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測HBV抗原表達(dá)情況;FT-PCR檢測HBV DNA載量;FH-PCR-MC驗(yàn)證細(xì)胞株拉米夫定耐藥變異類型;測序分析細(xì)胞株內(nèi)HBV的基因變異情況。結(jié)果成功建立HBV拉米夫定YVDD耐藥株和YMDD野生株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系;第1、10、30代細(xì)胞株HBsAg和HBeAg表達(dá)穩(wěn)定;第30代細(xì)胞內(nèi)及上清中HBV DNA載量高于10^4copies/mL;耐藥株變異類型為YVDD;測序顯示,細(xì)胞基因組攜帶的HBV耐藥株基因存在A1762T/G1764A/rtM204V/rtL180M/rtV173L的多位點(diǎn)聯(lián)合變異。結(jié)論成功建立HBV拉米夫定YVDD耐藥株和YMDD野生株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,即HepG2-HBV/CV和HepG2-HBV/CM細(xì)胞,為篩選抗HBV拉米夫定耐藥株的有效藥物提供了理想的細(xì)胞模型。
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