導(dǎo)言：作為寫作愛(ài)好者，不可錯(cuò)過(guò)為您精心挑選的10篇干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內(nèi)容能為您提供靈感和參考。

篇1

【關(guān)鍵詞】 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞 小鼠 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞分化 Hirschsprung病

0引言

應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細(xì)胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)著重進(jìn)行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. ① DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機(jī)械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過(guò)濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)先配置的無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以 6×108個(gè)/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng). 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細(xì)胞，以2/3量換液，孵育3 d后進(jìn)行傳代，以6×108個(gè)/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48 h后再次傳代，如有細(xì)胞團(tuán)塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL，動(dòng)態(tài)觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細(xì)胞特異性標(biāo)志物的染色應(yīng)用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測(cè)克隆球及其分化細(xì)胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1克隆球的生長(zhǎng)狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細(xì)胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán). 孵育24 h后，貼壁細(xì)胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細(xì)胞胞體增大，折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)分裂相，形成2～5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，另一部分呈聚集生長(zhǎng). 3 d后形成十幾或數(shù)十個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時(shí)向周圍伸出放射狀的細(xì)胞索，形成較小的次級(jí)克隆，這些克隆球形態(tài)完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無(wú)法觀察到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu) （圖1B）. 重新傳代培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞胞體增大，出現(xiàn)分裂相的克隆球數(shù)量逐漸增多，雜質(zhì)細(xì)胞減少，在連續(xù)傳代過(guò)程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養(yǎng)基12 h后，可見(jiàn)有細(xì)胞從克隆球中遷出，遷出的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；24 h后克隆球變扁，遷移出的細(xì)胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態(tài)；48 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，逐漸形成單細(xì)胞層且細(xì)胞形態(tài)多元化.

2.3克隆球及其分化細(xì)胞系的免疫染色免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發(fā)生和發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關(guān)［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發(fā)生障礙，受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)缺失，表明先天性巨結(jié)腸可能是一種干細(xì)胞疾病. 由于HSCR及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞性疾病在手術(shù)治療后仍遺留有嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此用干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行臨床治療已成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn). 鑒于胚胎干細(xì)胞的來(lái)源限制及免疫排斥問(wèn)題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗(yàn)提供新契機(jī).

GNCSCs的培養(yǎng)方法建立在中樞神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上. 依據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)典的培養(yǎng)方法，再結(jié)合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用簡(jiǎn)化的特殊培養(yǎng)劑和神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng). 連續(xù)傳10代后，GNCSCs的相對(duì)比例明顯增加，這種體外培養(yǎng)的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細(xì)胞. 如果繼續(xù)傳代，其純化程度越高，后續(xù)的試驗(yàn)效果將更佳. 連續(xù)傳代不僅純化了GNCSCs，還證實(shí)了干細(xì)胞的自我更新特性. 在體外培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)條件稍有變化可導(dǎo)致分化機(jī)制的啟動(dòng)，因此采用血清促分化法誘導(dǎo)GNCSCs分化既簡(jiǎn)單又可靠. 通過(guò)免疫染色，證實(shí)了GNCSCs分化細(xì)胞的類型，同時(shí)顯示了分化的亞型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，并表明了成體干細(xì)胞的多向分化能力.

參考文獻(xiàn)

［1］ 楊帆，楊樹(shù)源. 神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)綜述， 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

篇2

目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進(jìn)行鑒定、標(biāo)記。方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達(dá)率；電鏡檢查第3代MSCs超微結(jié)構(gòu)。DAPI標(biāo)記MSCs為下一步進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植示蹤。結(jié)果 原代培養(yǎng)的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達(dá)到80%～90%融合。第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽(yáng)性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則，可見(jiàn)較多微絨毛。DAPI可良好標(biāo)記MSCs細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光。結(jié)論 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標(biāo)記MSCs。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞培養(yǎng)；間充質(zhì)干細(xì)胞；種子細(xì)胞；示蹤劑

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴(kuò)增，因其來(lái)源充足、取材方便，體外增殖能力相對(duì)較強(qiáng)，而且在異體移植中排斥反應(yīng)小，被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎(chǔ)上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標(biāo)記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑和藥品

低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級(jí)胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉(cāng)鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過(guò)氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲(chǔ)存液(Sigma 公司)。

1.3 分離和培養(yǎng)

Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無(wú)菌條件下分離股骨、脛骨，無(wú)血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細(xì)胞接種在100 ml培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37℃下培養(yǎng)24～48 h，換液，去除未貼壁細(xì)胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細(xì)胞融合情況，細(xì)胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細(xì)胞。

1.4 透射電鏡樣品制備

將培養(yǎng)3代10 cm2培養(yǎng)皿中約2×106個(gè)細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。

1.5 MSCs表面標(biāo)記物檢測(cè)

0.25%胰酶消化收獲第3代細(xì)胞，收集1×106個(gè)細(xì)胞，洗滌1次，0～4℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對(duì)照混勻，室溫下閉光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌細(xì)胞，置于冰上，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 MSCs標(biāo)記

將無(wú)菌的DAPI 儲(chǔ)存液加入培養(yǎng)的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細(xì)胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見(jiàn)MSCs細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細(xì)胞清晰可見(jiàn)，2～3 d后可見(jiàn)少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，伸出偽足呈逗點(diǎn)狀或短棒狀；6 d左右可見(jiàn)放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細(xì)胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞貼壁快，24 h內(nèi)已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長(zhǎng)，3～4 d可見(jiàn)長(zhǎng)梭形細(xì)胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見(jiàn)圖1。

2.3 MSCs的鑒定及標(biāo)記

第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽(yáng)性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見(jiàn)圖3。細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核呈藍(lán)色。見(jiàn)圖4。

3 討 論

由于骨髓的細(xì)胞組成復(fù)雜，細(xì)胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細(xì)胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡(jiǎn)單，既降低了離心對(duì)細(xì)胞的損害，又減少了污染機(jī)會(huì)，且分離的MSCs貼壁時(shí)間短，增殖快，細(xì)胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡(jiǎn)單有效的MSCs分離方法。

一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標(biāo)志物〔5〕，而MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原CD38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面抗原CD14。因此，實(shí)驗(yàn)選取MSCs表達(dá)陽(yáng)性的指標(biāo)CD29、CD44，以及表達(dá)陰性的指標(biāo)CD34和CD45作為鑒定參考指標(biāo)〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞CD29和CD44陽(yáng)性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩(wěn)定的種子細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究。

DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測(cè)。DAPI對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒性，不改變細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，熒光保持時(shí)間較長(zhǎng)。移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的，目前常用的標(biāo)記法有DAPI標(biāo)記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記法、染色體標(biāo)記法、基因標(biāo)記法。BrdU法存在只能標(biāo)記增殖期細(xì)胞，且標(biāo)記細(xì)胞不能直接觀察等不足。染色體標(biāo)記主要將雄性供體動(dòng)物細(xì)胞移植到雌性動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)Y染色體雜交區(qū)別確認(rèn)移植細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于可以終生標(biāo)記，但也存在操作繁瑣，無(wú)法觀察活細(xì)胞等不足?；驑?biāo)記法通過(guò)基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材，使被標(biāo)記細(xì)胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報(bào)告基因。但目前，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因在目的細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)仍然存在程序繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成功率低等困難，而從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材又因?yàn)閯?dòng)物來(lái)源困難，在國(guó)內(nèi)較少開(kāi)展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標(biāo)記率很高(接近100%)，1 w內(nèi)可維持80%～90%標(biāo)記率。但隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)，其標(biāo)記效率迅速下降，3 w以后絕大多數(shù)細(xì)胞失去標(biāo)記。

本實(shí)驗(yàn)完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高，可以為體內(nèi)移植提供大量的種子細(xì)胞。采用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見(jiàn)所有MSCs 均已被標(biāo)記藍(lán)色熒光，提示DAPI 標(biāo)記法敏感性好，標(biāo)記效率高，可應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植的良好標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)

1 Gnecchi M.Melo LG.Bone marrowderived mesenchymal stem cells：Isolation，expansion，characterization，viral transduction，and production of conditioned medium〔J〕.Methods Mol Bol，2009;482:28194.

2 楊 麗，張榮華，謝厚杰，等.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009;13(6):10648.

3 Wakitani S，Saito T，Caplan AL.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5azacytidine〔J〕.Muscle Nerve，1995;18:141726.

4 賴平平，韓春茂，岑航輝，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)性狀〔J〕.浙江醫(yī)學(xué)，2004;26(5):32830.

篇3

自lichter等[1]1981年首次報(bào)道了甘藍(lán)型油菜游離小孢子培養(yǎng)并成功獲得了再生苗,在后來(lái)的20多年里,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)成功地在甘藍(lán)型油菜中建立了小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系,特別是用此種方法從培育的dh群體中獲得的多種油菜品種已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了廣泛的認(rèn)可?，F(xiàn)將甘藍(lán)型油菜小孢子加倍培養(yǎng)技術(shù)介紹如下。

1選取花蕾

一般在天氣晴朗的8~10時(shí)取材,如遇陰雨天氣,為了不影響試驗(yàn)進(jìn)程也可取材,但一定要選取生長(zhǎng)良好的花序,研究報(bào)道低溫有利于小孢子的胚胎發(fā)生。盡量選取主花序或生長(zhǎng)狀態(tài)較好的花序,然后在實(shí)驗(yàn)室選取大小在2.5~3.5mm的花蕾備用。不同的材料花蕾的發(fā)育時(shí)期不盡相同,可以剝蕾挑取小孢子進(jìn)行鏡檢以確定發(fā)育時(shí)期,最佳時(shí)期為單核晚期至二核期?；ㄋ帪榈G色呈透明狀。取蕾以后如果不能立刻進(jìn)行小孢子的提取,應(yīng)將花蕾放置于濕潤(rùn)的條件下低溫保存。

2游離小孢子分離

先用75%的醫(yī)用酒精將花蕾表面滅菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用無(wú)菌水沖漂洗3次,每次5min。將消毒的花蕾置于滅過(guò)菌的玻璃管中,加約2ml b5提取液,用滅菌玻璃棒將花蕾研碎,壓出花粉小孢子,通過(guò)2層槽式無(wú)菌濾紙,或45μm的尼龍網(wǎng),或0.22μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾,把濾液倒入滅菌了的帶蓋的10ml離心管里,用滴管吸b5抽提培養(yǎng)液沖洗過(guò)濾器中的花粉,沖2~3次后,在10ml離心管中將花粉懸浮液稀釋;將花粉懸浮液離心,800rpm,離心5min;將離心管中的上層清液吸去,再加液體b5抽提液,并將沉淀的花粉用吸管沖散,再次懸浮離心(用封口膜封口),1 800rpm,離心5min,吸去上層清液。

3小孢子加倍培養(yǎng)

將沉淀的花粉用nln-16 液體培養(yǎng)基稀釋,稀釋不要超過(guò)10ml,因?yàn)榧颖逗筮€要在10ml的離心管中再次稀釋離心,倒入三角瓶在32℃條件下暗培養(yǎng)2d左右(48~72h);然后檢查是否有污染,如果沒(méi)有污染,則分皿繼續(xù)培養(yǎng)。

4胚誘導(dǎo)培養(yǎng)

將加倍后的nln-16花粉懸浮液倒入離心管離心,800rpm,離心5min,倒掉nln-16液體;將沉淀的花粉用nln-13培養(yǎng)液稀釋,稀釋后的懸浮液分裝入7.5cm培養(yǎng)皿,一般每皿加入懸浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0個(gè)/ml,小孢子密度為10~50萬(wàn)個(gè)/ml,用封口膜封口;將封口的培養(yǎng)皿在25℃的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng),10d左右開(kāi)始查看是否有可見(jiàn)的顆粒狀胚,如果沒(méi)有則繼續(xù)培養(yǎng)[2]。

5胚狀體培養(yǎng)

當(dāng)肉眼可見(jiàn)的小胚狀體出現(xiàn)時(shí),把培養(yǎng)皿放在搖床上振蕩暗培養(yǎng)5~7d,轉(zhuǎn)速為80～100rpm。然后將魚雷形、子葉形胚狀體移植到b5固體培養(yǎng)基上,在25℃光暗交替條件下持續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)植株再生[3]。

6再生苗培養(yǎng)

培養(yǎng)1~2周后,見(jiàn)到子葉長(zhǎng)大變綠,胚根伸長(zhǎng),長(zhǎng)滿白色根毛。繼續(xù)培養(yǎng)后形成真葉,胚根不再伸長(zhǎng)。當(dāng)達(dá)到3～4片真葉時(shí),再轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培養(yǎng)基上進(jìn)行扦插繁殖,獲得完整植株。

7再生植株倍性鑒定

對(duì)再生植株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定(染色體數(shù)目)或在開(kāi)花以后根據(jù)花器形態(tài)(雄蕊和花瓣形態(tài))進(jìn)行鑒定[4-7]。若是單倍體植株,需要再加倍培養(yǎng)成雙倍體,可以把帶有秋水仙堿溶液的脫脂棉蓋在植株的頂芽、腋芽上;或者初花期把單倍體植株從土壤中取出,洗凈根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙堿溶液泡1.5～8.0h,再移栽田間;或者胚狀體再生獲得的試管苗,在含10～100mg/l秋水仙堿的b5液體培養(yǎng)基中無(wú)菌培養(yǎng)4～8d,轉(zhuǎn)到無(wú)秋水仙堿的b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。

8參考文獻(xiàn)

[1] lichter r.introduction of haploid plants from isolated pollen of brassica napus l[j].zpflanzenphysiol,1982(105):427-434.

[2] 石淑穩(wěn),周永明,吳江生,等.

甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)、染色體加倍、試管苗繼越夏和田間移栽配套技術(shù)的研究及其在油菜育種中的應(yīng)用[j].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2001,17(2):57-59.

[3] 余鳳群,劉后利.提高甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體成苗率的某些培養(yǎng)因素研究[j].作物學(xué)報(bào),1997,23(2):165-168.

[4] 祁永瓊,林良斌.油菜小孢子再生體系的研究進(jìn)展[j].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,18(2):208-211.

[5] 姜鳳英,馮輝.羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)初報(bào)[j].園藝學(xué)報(bào),2005,32(5):884.

[6] 石淑穩(wěn),吳江生,周永明,等.甘藍(lán)型油菜小孢子單倍體二倍化技術(shù)的研究[j].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2002,24(1):1-5.

篇4

為此，在2010年，山東信得專門成立動(dòng)物疫苗有限公司，并投資1.5億元建成了國(guó)內(nèi)首家大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)高致病性禽流感滅活疫苗的GMP車間，并于次年初通過(guò)了農(nóng)業(yè)部的GMP動(dòng)態(tài)驗(yàn)收，獲得GMP證書和獸藥生產(chǎn)許可證。2012年，山東信得獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的禽流感細(xì)胞苗新獸藥證書。

“此次獲得重組禽流感病毒（H5N1亞型）滅活疫苗的生產(chǎn)文號(hào)，標(biāo)志著山東信得研發(fā)生產(chǎn)的產(chǎn)品將由此進(jìn)入規(guī)模生產(chǎn)階段，并能面向市場(chǎng)供應(yīng)。”山東信得有關(guān)負(fù)責(zé)人表示，同時(shí)也說(shuō)明了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)打破多年來(lái)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)行業(yè)一直采用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗的技術(shù)瓶頸，標(biāo)志著我國(guó)在禽流感疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)方面，已經(jīng)走到了世界技術(shù)前沿，具有極大的引領(lǐng)和示范作用。

篇5

【關(guān)鍵詞】 乙醇 肝細(xì)胞 原代培養(yǎng) 柴胡皂苷-d 保護(hù)作用 機(jī)制

隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對(duì)肝臟的損害日漸突出。了解酒精對(duì)肝損傷的機(jī)制，篩選有效預(yù)防和治療酒精性肝損傷的藥物應(yīng)用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復(fù)方對(duì)酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究和報(bào)道比較多，單味制劑報(bào)道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強(qiáng)。整體水平研究表明柴胡皂苷對(duì)酒精性肝損傷有預(yù)防作用［1］。本文建立體外乙醇損傷肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究柴胡有效成分SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1 器材與方法

1.1 藥品與試劑 SS-d（純度98%），昆明長(zhǎng)春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過(guò)濾除菌，調(diào)pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2，定溶到1 000 ml，過(guò)濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，鏈霉素100 μg·ml－1，胰島素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠，2～4 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級(jí)，承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Bayer公司），721W微機(jī)型分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠），離心機(jī)（TGL.16G 上海）。

1.4 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無(wú)菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結(jié)締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細(xì)胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾后用培養(yǎng)液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>85%，按1 ×109個(gè)·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液去除血細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.5 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的建立將含肝細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板，設(shè)正常對(duì)照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14個(gè)劑量組，肝細(xì)胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測(cè)定ALT活性，MTT法測(cè)定肝細(xì)胞存活率。

1．6 MTT法選擇SS-d的實(shí)驗(yàn)濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。將肝細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)72 h更換培養(yǎng)液，換用SS-d稀釋液培養(yǎng)，另設(shè)空白對(duì)照組，12 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 μl，混勻以溶解被還原的MTT結(jié)晶，檢測(cè)波長(zhǎng)為492 nm的光密度值，計(jì)算藥物不同稀釋濃度下細(xì)胞的存活率。

1.7 SS-d對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用取培養(yǎng)72 h肝細(xì)胞，設(shè)乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L－1，同時(shí)SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對(duì)照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測(cè)ALT活性，收集肝細(xì)胞檢測(cè)MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測(cè)定肝細(xì)胞的存活率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以 表示，用SPSS計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 組間比較采用t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 乙醇對(duì)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L－1作用不明顯，光鏡下細(xì)胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細(xì)胞存活率呈進(jìn)行性降低，反映肝細(xì)胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L－1制備肝細(xì)胞損傷模型。見(jiàn)表1。表1 不同濃度乙醇對(duì)肝細(xì)胞ALT水平及細(xì)胞存活率的影響 與空白對(duì)照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.2 SS-d 實(shí)驗(yàn)濃度的選擇SS-d不同濃度時(shí)細(xì)胞存活率見(jiàn)表2，為避免藥物濃度過(guò)大所致的細(xì)胞毒性作用，應(yīng)選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響即肝細(xì)胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作為實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度。見(jiàn)表2。表2 不同濃度SS-d對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.3 SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞損傷明顯，大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)ALT釋放量明顯升高，細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增高，GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護(hù)后， 培養(yǎng)液中ALT水平明顯降低；肝細(xì)胞MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細(xì)胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能夠保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，其保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)。見(jiàn)表3。表3 SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞ALT，MDA，GSH-px水平與對(duì)照組比較，*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

3 討論

大量研究表明，乙醇對(duì)肝細(xì)胞損傷是通過(guò)自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化作用進(jìn)行的［3～5］。乙醇在肝臟代謝時(shí)產(chǎn)生大量自由基，自由基除直接損傷肝細(xì)胞外，可引起肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，膜流動(dòng)性失常，大量肝內(nèi)酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細(xì)胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細(xì)胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，才能保護(hù)肝細(xì)胞，恢復(fù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用［7，8］。但對(duì)單體SS－d保肝作用研究報(bào)道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平上對(duì)SS-d保肝作用機(jī)制進(jìn)行探討。本研究顯示，模型組肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯升高，肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細(xì)胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細(xì)胞氧化損傷；給予SS－d保護(hù)后，和模型組比較，肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細(xì)胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能是：①SS-d能增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化防御能力，抑制自由基的產(chǎn)生；②穩(wěn)定肝細(xì)胞膜系統(tǒng)，提高膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，防止肝細(xì)胞損傷和壞死。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ 李素婷，齊潔敏，楊鶴梅，等. 柴胡總提物對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，24（1）：9.

［2］ 謝華福，甘 淋，李 娟，等. 一種簡(jiǎn)單的肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，26（4）：306.

［3］ Sergent O，Pereira M，Belhomme C，et al.Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther，2005，1:5.

［4］ Stewart SF，Vidali M，Day CP，et al.Oxidative stress as a trigger for cellular responses in patients with alcoholic liver disease［J］. Hepatology，2004，39:197.

［5］ 鄧 源，班春林，武曉瓊. 乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 華北國(guó)際醫(yī)藥，2005，17（4）:242.

篇6

一、MDCK 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)可謂是理想的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方式，懸浮培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器中，在人工條件下，高效率大規(guī)模的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)而應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)的技術(shù)，可根據(jù)細(xì)胞的貼壁能力分為微載體懸浮培養(yǎng)方式和全懸浮培養(yǎng)方式。

1. 微載體懸浮培養(yǎng)。MDCK 細(xì)胞是從犬腎分離出來(lái)的一種貼壁依賴性上皮細(xì)胞，且它具有典型的“失巢凋亡”現(xiàn)象，即一種特殊的細(xì)胞程序死亡，是由于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或相鄰細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的，也就是說(shuō)依靠傳統(tǒng)的馴化方式或者單純的用機(jī)械攪拌使MDCK 細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)難度相當(dāng)大。Van Wezel 創(chuàng)立的微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)的先河，更為準(zhǔn)確的說(shuō)是使貼壁細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為現(xiàn)實(shí)。微載體懸浮培養(yǎng)是一種先進(jìn)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，其原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒加入到生物反應(yīng)器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞能在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)加以持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。反應(yīng)器中使用微載體是一種可以提高細(xì)胞濃度的策略，其細(xì)胞密度可達(dá)1×107 cells/ml。

采用微載體培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞，結(jié)合了懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，包括（1）細(xì)胞貼壁表面積大大增加，培養(yǎng)基利用充分，細(xì)胞密度增大。（2）微載體可在攪拌停止時(shí)沉降，便于將培養(yǎng)基與細(xì)胞分離。（3）與方瓶貼壁培養(yǎng)時(shí)的代謝變化不大，正常培養(yǎng)基可通用等等。

但是，目前生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)研究只是單批次的培養(yǎng)，其消化放大培養(yǎng)依舊是難題。且微載體培養(yǎng)過(guò)程中一般添加了血清，給下游純化帶來(lái)了巨大壓力。采用商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基，會(huì)大大增加企業(yè)生產(chǎn)成本。因此，自主開(kāi)發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行MDCK 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是目前的發(fā)展趨勢(shì)。

2. 無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。我們知道，生物制品生產(chǎn)尤其是細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)病毒疫苗的過(guò)程十分嚴(yán)謹(jǐn)。細(xì)胞培養(yǎng)需添加血清，可是血清的加入無(wú)疑給生產(chǎn)后期的除雜純化等工藝帶來(lái)難度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1 和HA2，能夠介導(dǎo)病毒囊膜和靶細(xì)胞膜結(jié)合，病毒開(kāi)始繁殖，而MDCK 細(xì)胞本身不具備裂解HA 的蛋白酶類，所以常常添加胰蛋白酶來(lái)提高病毒產(chǎn)量，但是，細(xì)胞培養(yǎng)中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，這種矛盾致使MDCK 無(wú)血清培養(yǎng)問(wèn)題更亟需解決。目前，MDCK 無(wú)血清培養(yǎng)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，基本思路是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補(bǔ)加各種生物活性因子來(lái)替代血清，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)所需成分，配制出無(wú)血清培養(yǎng)基， 能夠支持MDCK 細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖。一般常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)添加因子有：胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，氫化可的松等等，再經(jīng)過(guò)對(duì)這些添加因子的添加量的優(yōu)化，最終確定無(wú)血清培養(yǎng)基成分。

現(xiàn)在，已有MDCK 細(xì)胞商業(yè)用無(wú)血清培養(yǎng)基，它們的成功問(wèn)世解決了這一大難題。通過(guò)直接法或間接法，即：原含血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞直接消化傳代換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)或逐步降低血清濃度直至降到無(wú)血清培養(yǎng)，使MDCK 細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良且能正常增殖傳代。

完成了MDCK 無(wú)血清培養(yǎng)后，MDCK 單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)仍在研究當(dāng)中，有文獻(xiàn)報(bào)道，已有馴化成功的MDCK 懸浮細(xì)胞系，但就市場(chǎng)應(yīng)用來(lái)看，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠成熟的?，F(xiàn)階段，馴化MDCK 細(xì)胞在適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馴化方法主要有以下幾種：（1）使用硅化方瓶培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)方瓶先用硅化劑處理，防止了細(xì)胞的貼壁，再通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基成分，使細(xì)胞增殖；（2）使用搖床或搖瓶體系，通過(guò)外力作用，防止細(xì)胞貼壁，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，然后擴(kuò)大培養(yǎng)。

二、 MDCK 細(xì)胞應(yīng)用于流感病毒疫苗生產(chǎn)

采用細(xì)胞系培養(yǎng)流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生產(chǎn)方法，市場(chǎng)銷售的一些貼壁細(xì)胞系如Vero 細(xì)胞，MDCK 細(xì)胞是應(yīng)用于流感疫苗研究最典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，經(jīng)研究，這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗免疫應(yīng)答效果和用雞胚生產(chǎn)的疫苗一樣好。MDCK 細(xì)胞應(yīng)用于流感疫苗生產(chǎn)有很多優(yōu)點(diǎn)：MDCK細(xì)胞易培養(yǎng)、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效擴(kuò)增流感病毒；MDCK 細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗可以應(yīng)用于對(duì)雞胚蛋白過(guò)敏的患者等等。在使用MDCK 貼壁細(xì)胞接流感病毒后，通常會(huì)有較高的細(xì)胞特異性產(chǎn)率；微載體懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高達(dá)9log2（1∶512）；就已知實(shí)驗(yàn)室用馴化出MDCK 懸浮細(xì)胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于貼壁細(xì)胞系。且已有疫苗廠商如Solvay 制藥公司采用無(wú)血清培養(yǎng)基、微載體技術(shù)制備出了MDCK細(xì)胞流感亞單位疫苗；諾華公司制備出了由MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在過(guò)去十幾年中，用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備流感疫苗生產(chǎn)方式已經(jīng)替代了傳統(tǒng)的使用雞胚生產(chǎn)方式。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的特征在于其靈活性和可擴(kuò)展性，然而，貼壁細(xì)胞易培養(yǎng)但是卻很難擴(kuò)大生產(chǎn)量，而如果使用微載體提供生長(zhǎng)表面又會(huì)大大增加其成本。所以要努力創(chuàng)建懸浮細(xì)胞系，特別是MDCK懸浮細(xì)胞系。

多年以來(lái)，監(jiān)管部門督促行業(yè)設(shè)立無(wú)血清培養(yǎng)流程，以避免污染。

然而，許多市售培養(yǎng)基仍然需要添加物，以達(dá)到高細(xì)胞密度和最大產(chǎn)物產(chǎn)量。理想的情況是，在疫苗生產(chǎn)中應(yīng)該使用不需添加另外的蛋白質(zhì)等混合物的已知成分的培養(yǎng)基。這不僅會(huì)降低批次變化的風(fēng)險(xiǎn)也有利于病毒收獲的下游處理。此外，疫苗生產(chǎn)過(guò)程可以被簡(jiǎn)化，可以直接接毒而不用更換培養(yǎng)基。

篇7

【中圖分類號(hào)】R587.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2013）03-0044-02

引言

研究表明，骨髓含有造血干細(xì)胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多種成體干細(xì)胞。EPCs主要分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，有助于血管疾病組織的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潛力的特點(diǎn)，研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化為成骨、軟骨、心肌、肌腱、上皮、內(nèi)皮等幾乎所有三胚層類型細(xì)胞的能力[1-3]，基于這個(gè)特性使BMMSCs成為了中藥誘導(dǎo)、臨床移植及一些分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞源。因此，本實(shí)驗(yàn)采用最簡(jiǎn)單普通貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠BMMSCs，若能得到較為純凈BMMSCs，在節(jié)約了培養(yǎng)BMMSCs成本基礎(chǔ)上，提供了一種既簡(jiǎn)單又能穩(wěn)定獲得純凈BMMSCs的方法，為相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提供豐富的BMMSCs。

1 材料和方法

時(shí)間及地點(diǎn)：于2009-09/2011-02在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。材料：清潔級(jí)SD大鼠，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作程序經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)。主要試劑：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）

實(shí)驗(yàn)方法：

大鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)：頸椎脫臼法處死2～3周齡SD大鼠，無(wú)菌條件下手術(shù)取下兩側(cè)完整股骨（連同肌肉），浸入0.1%新吉爾滅15 min；剝離股骨附著肌肉，并用含雙抗的D-PBS反復(fù)清洗。剪開(kāi)股骨兩端，用D-PBS沖洗骨髓腔，收集含骨髓細(xì)胞的洗脫液，1000 g離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基重懸浮，每只大鼠分離的骨髓細(xì)胞接種兩個(gè)T25培養(yǎng)瓶，置37 °C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d換液1次，同時(shí)洗脫未貼壁的血細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并照相。當(dāng)BMMSCs生長(zhǎng)匯合度達(dá)60～70 %時(shí)，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105個(gè)/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

篇8

研究結(jié)果發(fā)表在《組織工程》雜志中，文章詳細(xì)闡述了帝國(guó)學(xué)院研究小組將胚胎干細(xì)胞變成軟骨細(xì)胞的過(guò)程。這樣，醫(yī)生將可培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并將其移植到許多受損或患病的組織中，即使因運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的損傷也可用新的軟骨取而代之，甚至是進(jìn)行整容手術(shù)。

軟骨（Cartilage）是骨間非常密集的結(jié)締組織，允許關(guān)節(jié)之間進(jìn)行平滑的移動(dòng)。

文章的第一作者Archana Vats博士說(shuō)：“利用干細(xì)胞培養(yǎng)軟骨的技術(shù)在臨床研究中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。目前英國(guó)的老齡化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，長(zhǎng)壽不可避免地成為備受關(guān)注的話題。在此之前，醫(yī)生也能進(jìn)行關(guān)節(jié)移植，卻不能移植軟骨。而更換軟骨后就可以避免再對(duì)關(guān)節(jié)進(jìn)行移植?！?/p>

研究人員在特定系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的有蓋培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞，進(jìn)而促使其變成軟骨細(xì)胞。與生長(zhǎng)中的胚胎干細(xì)胞相比，在干細(xì)胞與軟骨的混合物中存在較高含量的膠原質(zhì)和軟骨蛋白。

篇9

[中圖分類號(hào)] R329 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）27-10-03

Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium

MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2

1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China

[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.

[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR

表皮干細(xì)胞為皮膚組織中的專能干細(xì)胞，是一種成年組織干細(xì)胞[1]，可增殖分化為表皮中各種細(xì)胞成分，保持皮膚正常的表皮結(jié)構(gòu)。表皮干細(xì)胞的分化方式有兩種：對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂。前者分裂成兩個(gè)和母細(xì)胞相同的子代干細(xì)胞；而后者則分裂成一個(gè)子代干細(xì)胞和一個(gè)與母細(xì)胞不同的短暫擴(kuò)增細(xì)胞（TAC）[2]，TAC屬定向祖細(xì)胞。近年來(lái)干細(xì)胞療法已成為治療多種疾病的新途徑，可替代、修復(fù)、加強(qiáng)受損的組織或器官的功能[3]。本研究應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)將表皮干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為結(jié)膜上皮細(xì)胞，通過(guò)對(duì)目的細(xì)胞生物特性的檢測(cè)，探討其在臨床眼表結(jié)膜重建治療中的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1人皮膚材料包皮標(biāo)本來(lái)自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)患者，無(wú)泌尿系統(tǒng)疾病感染，患者年齡18～30歲，所取包皮標(biāo)本均得到患者知情同意。

1.1.2結(jié)膜組織取自尸體眼正常結(jié)膜組織。

1.1.3試劑和儀器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；熒光定量試劑盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購(gòu)自TaKaRa公司（美國(guó)）；TRIZOL® Reagent RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；RNA提取反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司（美國(guó)）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR儀（Stratagene公司，美國(guó)）；MJ Research OpticonTM4熒光定量PCR儀（美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)取尸體眼結(jié)膜，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍，于無(wú)菌超凈臺(tái)剪除結(jié)膜下筋膜組織，將其上皮面向上平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，棄去消化液并用無(wú)菌虹膜恢復(fù)器刮取上皮組織，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化約20min，待倒置顯微鏡下見(jiàn)到上皮細(xì)胞充分消化為多個(gè)單細(xì)胞狀態(tài)時(shí)加入上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，收集細(xì)胞懸浮液，置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化的結(jié)膜上皮細(xì)胞，將其調(diào)整為1×104個(gè)/mL，在6孔Transwell培養(yǎng)板insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細(xì)胞懸液飼養(yǎng)細(xì)胞組為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組insert池中無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞，僅為相同體積的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2表皮干細(xì)胞的分離、篩選、培養(yǎng)取無(wú)菌手術(shù)獲得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L兩性霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液浸泡30min，無(wú)菌超凈臺(tái)剪除皮下組織，并剪成2mm×4mm皮條，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃過(guò)夜。次日用眼科鑷撕取表皮皮片，D-Hank’s液沖洗3次，并用眼科顯微剪將其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使細(xì)胞脫落，加入上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，200目細(xì)胞篩過(guò)濾得細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸浮液置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化所得的皮膚上皮細(xì)胞。將其以1×106個(gè)/mL密度接種于Ⅳ型膠原（100μg/mL）鋪底的培養(yǎng)瓶置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁20min后，去除未貼壁細(xì)胞，加入新的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2d換液一次。

1.2.3表皮干細(xì)胞與結(jié)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化取1～2代表皮干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，以5×106個(gè)/mL接種于6孔Transwell培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細(xì)胞（細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL）作為飼養(yǎng)細(xì)胞；對(duì)照組insert池中僅為相同體積的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、3、5、7d后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，分別取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提取RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表達(dá)情況。

1.2.4細(xì)胞總RNA的提取吸出6孔Transwell培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振蕩混勻，15～30℃溫育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振蕩15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃離心樣品15min（＜12 000g），將上層水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃離心（＜12 000g），棄上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗滌，振蕩樣品，然后7 500g離心樣品5min（如果用來(lái)富集小分子RNA，則不用75%乙醇洗滌，直接進(jìn)入下一步），空氣干燥RNA 10min，用適量RNase free水溶解，于60℃溫育10min，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5引物的構(gòu)建按照參考文獻(xiàn)[4]構(gòu)建設(shè)計(jì)：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。

1.2.6PCR擴(kuò)增取3μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募尤胂鄳?yīng)的正向引物和反向引物。PCR反應(yīng)總體系為20μL。條件為95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，1個(gè)循環(huán)。

1.2.7熒光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。取1μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，20μL反應(yīng)體系，引物濃度為10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用雙蒸水補(bǔ)平至20μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 10s，1個(gè)循環(huán)；94℃ 5s，58℃ 31s，讀板，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-CT方法。

2結(jié)果

Realtime RT-PCR的結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組表皮干細(xì)胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，分別為（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表達(dá)上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表達(dá)都有顯著性上調(diào)。

圖1表皮干細(xì)胞中β2-微球蛋白mRNA的表達(dá)水平5d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中β2-微球蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)（300±26）%（P＜0.01）；7d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中β2-微球蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6

圖2表皮干細(xì)胞中CK13 mRNA的表達(dá)水平5d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CK13 mRNA表達(dá)上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）；7d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CK13 mRNA表達(dá)上調(diào)（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6

3討論

角蛋白（keratin）是上皮細(xì)胞異性的中間絲成分。已知的細(xì)胞中表達(dá)的各種角蛋白家族亞單位成員具有組織特異性，并且和細(xì)胞的分化相關(guān)[5]。例如：Krenzer等[6]報(bào)道：在正常結(jié)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究報(bào)道：通過(guò)對(duì)38例正常結(jié)膜組織的上皮細(xì)胞建立的cDNA文庫(kù)，檢測(cè)出角蛋白K13是結(jié)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中表達(dá)最豐富的基因，且該基因與細(xì)胞骨架的合成有關(guān)，并認(rèn)為K13有可能是有關(guān)眼表結(jié)膜細(xì)胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也證明：在結(jié)膜上皮細(xì)胞的免疫組化鑒定中結(jié)膜上皮細(xì)胞可被特異性角蛋白K13抗體標(biāo)記，而在皮膚干細(xì)胞中并無(wú)相應(yīng)抗體的表達(dá)[8]。

β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。雖然有關(guān)該種蛋白的功能尚未明確，但是該蛋白存在于淚液中并可能來(lái)源于結(jié)膜上皮細(xì)胞中。并且在正常狀態(tài)下淚液中的β2-微球蛋白濃度明顯高于炎癥時(shí)淚液中濃度。Dota等[7]研究中也同時(shí)檢測(cè)到β2-微球蛋白也是結(jié)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄較高的基因，因此本研究將CK13和β2-微球蛋白作為結(jié)膜上皮細(xì)胞標(biāo)記性（特異性）的高效表達(dá)基因。

近年來(lái)，相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]報(bào)告了通過(guò)組織工程技術(shù)將成體干細(xì)胞體外合成生物替代品，并對(duì)其組織功能改良用于眼表重建的臨床治療新技術(shù)。然而，成功的眼表重建依賴于兩個(gè)重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干細(xì)胞；其二，干細(xì)胞的載體組織。本研究中應(yīng)用具有高分化、高增殖能力的表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞，從而保證眼表重建治療中能獲得可靠的細(xì)胞源。我們?cè)缙诘南嚓P(guān)研究中[4]報(bào)告應(yīng)用同源異體的結(jié)膜去細(xì)胞基質(zhì)膜為干細(xì)胞載體膜，不僅可保證具有良好的組織相容性，而且也確保在體外模擬形成結(jié)膜上皮細(xì)胞增殖的組織微環(huán)境。從而誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞定向分化、增殖。

研究結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)分化的表皮干細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)具有結(jié)膜上皮細(xì)胞的特異性基因CK13及β2-微球蛋白的高表達(dá)，提示該實(shí)驗(yàn)方法可誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞形成特異性短暫擴(kuò)增細(xì)胞（TAC），并能定向分化為類結(jié)膜上皮細(xì)胞。因此，在臨床上眼表重建的干細(xì)胞療法應(yīng)用中，該方法不僅可保證獲得充足的目的細(xì)胞來(lái)源，而且確保目的細(xì)胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。在眼表結(jié)膜組織的重建及生理功能恢復(fù)的臨床治療中提供有效的組織來(lái)源。但是，該研究方法中誘導(dǎo)分化的表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞能否合成人工結(jié)膜生物膜活體動(dòng)物眼表的存活狀況及生理功能重塑方面的問(wèn)題，還需要進(jìn)一步的研究探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Moore KA，Lemischka IR. Stem cells and their niches[J]. Science，2006，311（5769）：1880-1885.

[2] Finlan LE，Hupp TR. Epidermal stem cells and cancer stem cells: insights into cancer and potential therapeutic strategies[J]. Eur J Cancer，2006，42（9）：1283-1292.

[3] Hofmann S，Hagenmuller H，Koch AM，et al. Control of in vitro tissue-engineered bone-like structures using human mesenchymal stem cells and porous silk scaffolds[J]. Biomaterials，2007，28（6）：1152-1162.

[4] 孟繁劍，陳家祺. 人皮膚干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化構(gòu)建人工結(jié)膜的實(shí)驗(yàn)[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2006，27（3）：246-249.

[5] Adams JC，Watt FM. Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix[J]. Development，1993，117（4）：1183-1198.

[6] Krenzer KL，F(xiàn)reddo TF. Cytokeratin expression in normal human bulbar conjunctiva obtained by impression cytology[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1997，38（1）：142-152.

[7] Dota A，Nishida K，Adachi W，et al. An expression profile of active genes in human conjunctival epithelium[J]. Exp Eye Res，2001，72（3）：235-241.

[8] Moll R，F(xiàn)ranke WW，Schiller DL，et al. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells[J]. Cell，1982，31（1）：11-24.

[9] Rama P，Bonini S，Lambiase A，et al. Autologous fibrin-cultured limbal stem cells permanently restore the corneal surface of patients with total limbal stem cell deficiency[J]. Transplantation，2001，72（9）：1478-1485.

篇10

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細(xì)胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細(xì)胞的主要來(lái)源是臍帶血、骨髓。如果直接進(jìn)行骨髓移植，則需要進(jìn)行人體的白細(xì)胞抗原配型，否則發(fā)生免疫排異會(huì)危及患者生命。現(xiàn)有臍帶血庫(kù)儲(chǔ)存的造血干細(xì)胞免疫原性弱，但數(shù)量供不應(yīng)求，使其在疾病中的臨床應(yīng)用中受到限制。隨著誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（IPS）提取技術(shù)的出現(xiàn)，使分化自身細(xì)胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實(shí)，不但避免了倫理問(wèn)題，解決了免疫排斥問(wèn)題，造血干細(xì)胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過(guò)程報(bào)道如下：

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株的來(lái)源

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9購(gòu)于美國(guó)ATCC，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM，內(nèi)含20%的胎牛血清，OP9細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來(lái)自MACS公司?？贵w為APS-TRA-1-85，半固體培養(yǎng)基購(gòu)于SCT公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對(duì)照組細(xì)胞的未分化狀態(tài)，OP9用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)4天后，將OP9的培養(yǎng)液換成誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的培養(yǎng)液，將UC013細(xì)胞洗兩遍后，再對(duì)邊緣部位細(xì)胞進(jìn)行消化，將細(xì)胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細(xì)胞后，將其轉(zhuǎn)移到加有分化培養(yǎng)液的細(xì)胞盤中搖勻，在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液，第四天開(kāi)始每隔一天半換一次培養(yǎng)液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細(xì)胞，將細(xì)胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞收集到離心管中進(jìn)行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過(guò)濾后，向其中加入FCR和 CD34標(biāo)記細(xì)胞，30秒后加入流式細(xì)胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細(xì)胞緩沖液重懸。將制備好的細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離，通過(guò)流式細(xì)胞儀分離柱的CD34-細(xì)胞被移出分離柱棄之，最終，通過(guò)加壓洗脫分離柱上黏附的細(xì)胞，即得到CD34+細(xì)胞。

用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，將共培養(yǎng)9天后的細(xì)胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細(xì)胞過(guò)濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

集落形成實(shí)驗(yàn)。將分選的CD34+細(xì)胞接種到半固體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔接種1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)14-16天。然后，在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細(xì)胞形成特征，對(duì)集落細(xì)胞進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。同時(shí)，提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細(xì)胞的RNA，用RT-PCR法檢測(cè)各基因在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示，對(duì)照組未分化的人體細(xì)胞集落狀生長(zhǎng)，呈扁平狀，排列緊密，沒(méi)有分化的跡象。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2天后的細(xì)胞，表面布滿細(xì)胞集落，已進(jìn)行造血干細(xì)胞分化。OP9細(xì)胞貼著細(xì)胞壁生長(zhǎng)，細(xì)胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細(xì)胞排列規(guī)則，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)4天后細(xì)胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

2.2誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化

通過(guò)在本實(shí)驗(yàn)組的誘導(dǎo)分化條件下，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分化到一定程度后，便開(kāi)始大量克隆，細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了分化，接著，OP9細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)老化跡象。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

共培養(yǎng)9天后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞造血表面標(biāo)志物表達(dá)情況，用流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)細(xì)胞的CD34、CD43、CD31的表達(dá)情況，結(jié)果顯示表達(dá)上述表面標(biāo)志物的細(xì)胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測(cè)

運(yùn)用RT-PCR對(duì)共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示，IPS細(xì)胞發(fā)生造血分化時(shí)，Oct-4基因的表達(dá)慢慢消失；造血轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)緩慢升高；Runx-1基因在造血干細(xì)胞分化12天當(dāng)中的表達(dá)呈波浪式變化，其中分化第二天表達(dá)量最高，第四天開(kāi)始下降，第八天開(kāi)始升高；CD34在造血分化過(guò)程中的基因表達(dá)量逐漸增高。

2.5 CD34+細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)

CD34+細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)造血干細(xì)胞的形態(tài)特征，對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落數(shù)量持續(xù)升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數(shù)量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)誘導(dǎo)分化得到造血干細(xì)胞已經(jīng)成為事實(shí)。相對(duì)于多能干細(xì)胞而言，IPS通過(guò)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子以及重編程進(jìn)行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡(jiǎn)單穩(wěn)定，避免了胚胎干細(xì)胞面臨的倫理和法律等問(wèn)題，使IPS可以應(yīng)用于細(xì)胞替代性治療，并可以進(jìn)行疾病的機(jī)理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細(xì)胞分化得到的造血干細(xì)胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問(wèn)題。

在本文的研究中，沒(méi)有外加細(xì)胞因子，直接將IPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞，結(jié)果獲得了20%的CD34+細(xì)胞，即造血干細(xì)胞，CD34是表達(dá)于造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，表明IPS可以分化為造血干細(xì)胞，但是轉(zhuǎn)化率比較低。Runx1是調(diào)控造血干細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，期基因的表達(dá)量在分化過(guò)程中呈現(xiàn)波浪式的變化，Gata-2的表達(dá)則逐漸升高。體外分化得到的造血干細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài)，說(shuō)明IPS可以向各細(xì)胞系進(jìn)行分化。

現(xiàn)在多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進(jìn)行誘導(dǎo)生成造血干細(xì)胞；二是基質(zhì)細(xì)胞與多能干細(xì)胞共培養(yǎng)；三是形成EB后與OP9進(jìn)行共培養(yǎng)；四是單層誘導(dǎo)ESC生成造血干細(xì)胞。利用OP9細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境，為研究細(xì)胞定向分化為造血干細(xì)胞創(chuàng)造了可能性，OP9細(xì)胞主要支持早期的造血干細(xì)胞分化，并協(xié)助B淋巴細(xì)胞增殖?；|(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放的細(xì)胞因子支持造血干細(xì)胞的分化。這種誘導(dǎo)方法分化時(shí)間短，為臨床造血干細(xì)胞的移植提供了便利。誘導(dǎo)分化過(guò)程中不用添加細(xì)胞因子，比較經(jīng)濟(jì)。但該誘導(dǎo)方法也存在著一定的缺點(diǎn)，即存在鼠源性污染細(xì)胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應(yīng)用。

目前臨床上移植造血干細(xì)胞主要是用臍血和骨髓來(lái)源的造血干細(xì)胞，而體外分化和擴(kuò)增得到造血干細(xì)胞只能通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)獲得。將造血干細(xì)胞植入重建小鼠體內(nèi)，可以評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞的功能。體外分化獲得的造血干細(xì)胞和臍血中的造血干細(xì)胞與重建小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)差異較大，需要進(jìn)一步優(yōu)化體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的過(guò)程，才能滿足該實(shí)驗(yàn)需求

4 小結(jié)

通過(guò)將IPS定向分化為造血干細(xì)胞的研究，成功誘導(dǎo)了造血干細(xì)胞，分化得到的細(xì)胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術(shù)方法希望可以為IPS細(xì)胞在造血疾病中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：