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關(guān)鍵詞：癌 肝細(xì)胞 基因治療 融合蛋白 

摘要：目的構(gòu)建具有靶向去唾液酸糖蛋白受體、溶酶體逃逸、DNA結(jié)合的多功能融合蛋白，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行功能鑒定。方法合成編碼Melittin的兩條寡核苷酸單鏈（GenBank：X02007），退火形成寡核苷酸雙鏈；雙酶切含抗去唾液酸糖蛋白單鏈抗體（ASGPRseFv）c1基因的載體C1／plT2，0．7％低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收C1；以pSW50．Gal4為模板，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增Gal4基因；采用分子克隆技術(shù)將其定向克隆至載體pGC4C26H中，獲得重組質(zhì)粒C1MG／pGC4C26H；雙酶切載體C1MG／pGCAC26H，膠回收片段C1MG定向克隆至載體pET-32c中，將含C1MG／pET-32c的B121單菌落1：100接種至1000mlLB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用Ni“螯合柱親和純化，免疫印跡技術(shù)（Western blot）和免疫組織化學(xué)分析重組蛋白C1MG的抗原結(jié)合能力，溶血實(shí)驗(yàn)分析C1MG的生物學(xué)活性，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)分析C1MG的DNA結(jié)合能力。結(jié)果成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒C1MG!pET．32e，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)：在大腸桿菌BL21中有效表達(dá)重組融合蛋白C1MG；表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在；純化的C1MG大小為64．1kDa，濃度為0．6g／L；Westernblot結(jié)果說(shuō)明C1MG能有效識(shí)別重組ASGPR，免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)C1MG能結(jié)合到鼠肝細(xì)胞表面；溶血實(shí)驗(yàn)顯示C1MG具有裂解紅細(xì)胞膜功能；腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)C1MG將pEBAF／tk-GAL4rec質(zhì)粒有效地導(dǎo)入表達(dá)ASGPR的細(xì)胞中并表達(dá)TK基因，氯喹對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制無(wú)明顯影響。結(jié)論在大腸桿菌中成功表達(dá)和純化得到單鏈抗體一蜂毒肽一酵母轉(zhuǎn)錄因子（C1MG）的融合蛋白，該融合蛋白至少具有以下功能：ASGPR靶向識(shí)別能力、溶酶體膜裂解功能、以及DNA特異性結(jié)合功能，提示對(duì)肝癌的靶向治療有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

中華實(shí)驗(yàn)外科雜志要求:

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